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微量快速特异敏感现场裸眼检测监测多病原感染的高新技术—— 基于生物惰性载体菌和多病原特异检测靶标的发现和应用

发布人：朱国强

发布时间： 2022年08月03日

修改时间： 2022年08月04日

关键词：<多病原感染检测> <生物惰性载体> <靶标抗原>

分类：养殖 > 畜牧兽医 > 试剂盒 >

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知识产权信息
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概述：

本技术由全国颠覆性技术：生物惰性载体系统和靶标抗原技术支持，可用于多种动物多病原感染的现场快速检测和大规模监测，检测仅需5-20 μL血清样品，且无需特殊设备和仪器，仅需肉眼在2 min内完成结果判定。与常规血清学检测方法相比，本技术具有简易、经济、即时、特异、敏感等特点，同时可以满足大批量和现场检测的要求。目前本技术已授权相关国家发明专利9项，申请国际PCT专利5项均已进入终审。

技术原理：

1. 核心技术（1）生物惰性载体系统生物惰性载体系统是一种可以完全替代硝酸纤维素膜、聚苯乙烯板和聚苯乙烯微球等传统非生物抗原包被材料的生物材料。生物惰性载体系统由生物惰性载体和惰性延伸载体组成，前者发挥抗原初级放大作用，后者发挥二级和三级放大，因此远远颠覆了传统包被技术无法放大的窘境。生物惰性载体和惰性延伸载体两者相辅相成，保障了检测试剂的敏感性。生物惰性载体通过数以千计的生物筛选获得，通过多次基因工程编辑后与仁和动物血样均不反应。该技术申报专利前无相关报到，目前已授权国家发明专利4项，并申请国际PCT专利四项。惰性延伸载体的本质是天然的细菌V型分泌系统，是细菌向细胞膜外输出抗原的展示结构。本技术团队筛选和开发了三种惰性延伸载体，分别应用于牛羊、家禽和猪病原感染抗体的早期筛查的间接凝集试剂的研发。目前已授权1项基于惰性延伸载体的发明专利，正在申请国际PCT专利1项。（2）靶标抗原技术本单位提出的靶标抗原技术是一种结合电脑生物学、结构生物学、分子生物学和生物信息学等交叉学科融合而成的新技术。靶标抗原颠覆了传统完整蛋白质抗原分子量大、表面电荷复杂、交叉反应强、不稳定易降解等缺陷，并依托于生物惰性载体技术，实现了血清学检测抗原的第四级放大。做一个形象的比喻，将生物惰性载体比作大树粗壮的树干，惰性延伸载体好比树干上延伸的树枝，而靶标抗原便是树枝的进一步放大延伸，即位于大树末端的树梢。靶标抗原具有专一性，能分别结合针对病原的感染性抗体（好比树梢上的鸟），这个反应过程通过间接凝集技术展示，最终形成肉眼可见的凝集颗粒（靶标抗原-抗体复合物聚合体）。目前，本团队基于靶标抗原技术已取得4项发明专利授权，并已研发出针对牛羊、家禽和猪病原靶标抗原用于检测结果的相互验证，并基于相关参数优化和推出相关凝集检测监测产品3种。关于牛羊、家禽和猪病原靶标抗原检测产品的2项发明专利申请正在申请。 2. 配套技术（1）基于生物信息学和结构生物学的靶标抗原筛选技术由于病原感染机制十分复杂，找到合适的靶标抗原是决定检测敏感性和特异性的根本保障。基于生物信息学和结构生物学的靶标抗原筛选技术能够通过计算机模拟和选定免疫原性好的靶标抗原，从而加快病原感染抗体检测相关试剂的研发。（2）基于生物惰性载体和靶标抗原的间接凝集试剂制备技术基于生物惰性载体和靶标抗原的间接凝集试剂制备技术是研发检测试剂平台的关键技术。利用该技术可以实现检测试剂的快速制备，检测效果的快速验证，和大规模批量生产。

创新点：

1. 泛性型生物惰性载体的发现和应用。泛性型生物惰性载体是本技术至关重要的研究平台，与此前的惰性载体为乳胶颗粒、纳米金属等非生物材料完全不同的功能，本研究中发现和探索的生物性惰性载体乃是世界首创的、“活性”惰性载体。由于该生物惰性载体与任何年龄的人、任何品种的动物血清、血浆和全血均不发生非特异性反应，故称为泛性型生物惰性载体。基于该研究平台相关的研究内容已获得认可，目前在该方向已申请国家发明专利6项，授权5项，1项已通过实质性审查；同时申请国际PCT专利5项。 2. 首次建立基于生物惰性载体的抗原展呈系统。抗原展呈是指抗原以具有功能和活性的形式展呈表达并暴露在生物载体表面，然而如果载体是非生物材料，则只能将有限抗原包被在表面，考虑包被抗原为异源表达、纯化的蛋白质，与功能性天然抗原的构象不一致。而本研究建立的基于生物惰性载体的抗原展呈系统则是以生物惰性载体为基础，展呈的是功能性天然的抗原构象，且调控抗原大量表达，从而大大提高检测的敏感性和靶向抗原的特异性。 3. 首次建立基于靶靶标抗原的检测方法。靶标抗原是病原建立感染过程中首要发挥免疫应答作用的大分子黏附素、抗原表位和其特异性受体结合域。本研究组合多表位融合抗原技术平台、V型分泌系统和其载客结构域功能，将基于泛性型惰性载体菌表面展呈表达靶向抗原抗体组合的新颖间接凝集试验率先应用于现场诊断。 4. 首次提出具有多系统对照的检测技术。目前的血清学检测方法没有样品本身对照，以ELISA：ELISA判定结果是以系统“cut off值”为标准，高于“cut off值”为阳性，而低于“cut off值”为阴性。其后果是无法排除个体差异造成的干扰，导致假阳性变多；并且使得一些位于“cut off值”附近的结果重复性差，判定变得模棱两可。缺乏样品本身的系统对照是传统血清学检测方法的共性问题，所谓样品本身对照是指某一份样品检测应该具备能够建立结果判定的对照系统。本研究建立了多样品本身对照的检测方案：系统样品对照1是生物多性载体系统，可以反映载体系统的惰性能力和检测样品是否变质变性，数据是否可信；系统样品对照2是缺乏靶标抗原检测系统的靶标抗原，该对照与检测系统仅相差靶标抗原。因此，如果检测某一份样品时，系统对照1和系统对照2均为阴性，而靶点抗原检测系统为阳性则可判定为阳性；如果系统对照1和系统对照2均为阴性，而靶点抗原检测系统为阴性则可判定为阴性。具有多样品本身对照的检测方法结果判断快，没有主观性带来的干扰。 5. 实现多靶标、多病原感染的检测和监测。目前没有任何一种血清学检测技术能够做到多靶标、多病原感染的检测和监测，这是因为如果想要进行多靶标、多病原感染的检测就需要表达、纯化各类抗原，这是一项及其耗费人力物力的工作，其次是多种抗原无法进行同时包被和应用，只能分别包被和检测，因为同时包被会增加难以避免的非特异性反应，换句话说，目前所谓的多病原检测方法均为多种试剂盒组合而成的多重检测。但是本研究开发出的多靶标、多病原感染的检测和监测与之不同，用于检测不同病原的靶点抗原在本系统平台上不会导致非特异性反应的出现，这些靶标抗原相互之间没有互相作用影响，且具有各自的生物活性和功能。因此，对于同一份待检样品在检测监测体系只需要加一次样就可以得知是否有多病原感染的可能性，然后通过特定病原体的靶标抗原加以分别验证即可确诊。

主要技术指标：

本技术通过与正在且一直应用的血清学技术从敏感性、特异性、重复稳定性进行了对比，均优先正在应用的血清学检测方法。值得注意的是，从检测效率和便捷性方面考虑，本方法仅需5-20 μL（约1滴血）和2 min的检测时间已在上述方法中一骑绝尘。成本控制大大缩减。综上所述，本检测技术平台有望实现对现有技术的革新替代。

节本增效情况：

1. 牛羊布鲁氏菌病和结核病（“两病”）检测技术应用和推广情况（1）中国动物疾控中心布病研究室（董浩博士，主任），测试验证牛、羊布病样品多批，鉴于虎红平板凝集试验在羊上使用的局限性，每批大于30份样品测试验证山羊和绵羊布病样品多批，每批大于30份样品。基本找出在羊上使用的局限性因素。（2）中国兽药监察所，国家动物布病参考实验室，OIE动物布病参考实验室（丁家波博士，主任），已测试验证牛布病样品多批，并作比较验证和阴性结果的排查分析。（3）中国动物卫生与流行病学中心（山东青岛）动物布病研究室（邵卫星博士，主任）测试验证牛布病样品多批，贵单位联合虎红平板凝集试验、试管凝集试验和偏振光试验的一致结果与我们方法结果的一致性，再次验证我们方法的快速敏感特异性优势。（4）中国兽药监察所，科技部十三五重点研发项目动物布病研究首席科学家（毛开荣研究员，主任）测试验证牛布病样品，得到他本人的满意肯定。（5）全国多地区送检样品多批测试和验证，包括江苏徐州，河北，广西、贵州等地比较检测WHO阳性血清(已5倍稀释的工作浓度)还能继续稀释32倍（1：32），能检出，敏感性非常高；检测中监所阳性血清（阳11#）工作浓度，还能继续稀释至1:4，可检出；检测临床牛血清（300268 睢宁）至少稀释至1:4，可检出；比较检出不同动物布病抗体,我们发现该方法结果反映出牛和羊样品有一定的差异性，需要优化羊样品测试条件，我们也找到羊样品测试优化条件。 2. 猪重要病原感染检测技术应用和推广情况（1）2021年8月，扬州大学测试中心利用竞争ELISA检测了80份猪血清样品的非洲猪瘟病毒（ASFV）感染抗体，随后用本方法加以验证，结果发现3份接近但未达到Cut off值的检测样品利用本方法可检测出阳性，证明本方法的敏感性高于ELISA。（2）2021年11月，检测江苏农业科学院兽医所在哈尔滨兽医研究所人工感染ASFV获得的20份猪血清血清，经过本技术两种不同靶标抗原检测，均能检测出ASFV感染性抗体。（3）在2021年10月-2022年3月，扬州大学测试中心提供了来自江苏、浙江、安徽和山东等地的猪血清样品，这些样品均经过荧光定量PCR检测。结果表明，本方法能够检测出所有荧光定量为阳性的结果，并且发现部分荧光定量为阴性的结果利用本方法也检测为阳性，该结果表明核酸检测局限在血液中出现病毒血症后，因此核酸检测不利于ASFV早期防控。（4）上海市农业科学院，李本强研究院提供的猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染阳性猪血清和SPF猪血清，江苏省农业科学院兽医所提供的传染性胃肠炎病毒（TGEV）血清和PEDV血清，经本方法验证100%符合。 3. 家禽种源性疾病感染检测技术的应用和推广（1）北京中农榜样蛋鸡育种有限责任公司提供了10份鸡白痢沙门氏菌商品化凝集抗原检测阳性的鸡血清，经本技术检测，证明这些血清感染背景复杂，不仅包括鸡白痢沙门氏菌感染，还存在肠炎、鼠伤寒沙门氏菌感染，以及混合感染。该结果证实目前商品化凝集抗原存在交叉反应和敏感性不佳的局限性。（2）深圳市绿诗源生物技术有限公司、云南大学动物医学院和安徽荣达生物技术有限公司对本课题组研发的鸡白痢、肠炎沙门氏菌感染抗体检测试剂进行了第三方验证，以商品化凝集抗原作为标准，符合率为85%左右，以细菌分离鉴定为标准，符合率为100%。该结果说明了本方法的特异性远远高于正在应用的商品化凝集抗原。（3）安徽荣达生物技术有限公司和江苏省家禽科学研究所国家基因库利用本技术试剂在祖代鸡实施鸡白痢沙门氏菌和禽白血病病毒两种种源性疾病的检测和净化验证。通过淘汰阳性父母代鸡，成功在子一代（F1代）实现了“两百的净化”。（4）华南农业大学和广东温氏家禽有限公司目前正在将本课题组研发的鸡白痢沙门氏菌和禽白血病病毒感染检测试剂进行推广，目前正在对推广反馈的意见进行汇总和改进。

市场应用前景：

团队旨在建立一种在敏感性、特异性、检测便捷性、检测效率、成本等方面突破目前正在应用的血清学检测方法的技术瓶颈。这种技术可以应用于人和动物各类多种疾病（包括感染性疾病、病原感染相关肿瘤性疾病等）的检测和监测，也可以在人医学体检中实施精准监测、诊断，且检测成本大大降低，具有广泛的商业应用前景！

适宜条件（领域、区域）：

1. 牛、羊养殖单位和检疫工作单位奶牛“两病”是指奶牛结核病和奶牛布鲁氏菌病，为二类动物疫病，都是人畜共患传染病。随着全国大市场、大流通的进一步形成，奶牛交易频繁，奶牛“两病”的发生呈上升趋势。据报道，我国是全球结核病最严重的国家之一，人的结核病13%来自牛的结核分枝杆菌感染，人牛结核病的交叉感染是造成我国结核病流行的原因之一；布病也有上升趋势，在2021年的一项调查中，全国11个省（自治区）采集的10231份牛血清样品布鲁菌病阳性率达46.52%，某地一牛场60%的牛检出布病阳性，10个兽医、配种员中就有9人感染布病。因此，对于奶牛场“两病”的日常监测丝毫不能松懈。本技术产品可实现快速、准确监测牛羊“两病”。 2. 养猪场自2018年我国报道首例非洲猪瘟病例开始，我国养猪业承受了巨大的损失，但截止目前没有标准化的防控手段和策略。本技术团队研发的非洲猪瘟感染检测试剂的敏感性好，检出时间能早于核酸检测方法，在养殖栋舍的早期精准“拔牙”能够发挥关键作用。 3. 家禽养殖单位、家禽基因保种单位和家禽疫病净化示范场建设单位目前传统家禽疫病净化采用连续穿带，代代监测的方略，这种方案耗时长、投入大。而利用本团队的研发产品清除阳性父母家禽，便能够实现在子一代（F1代）疫病的净化。

其他：

预期目标
1. 技术和产品推广
技术团队负责人为江苏省奶牛产业技术体系疾病防控创新团队岗位专家。目前本技术依托体系现建有江苏省示范推广基地7个，辐射和服务规模化奶牛场20余个，并在2023年实现江苏省的主要奶牛养殖基地的技术覆盖。
目前本团队已与扬州的多家养猪单位进行合作，对技术研发和产品试点应用起到了关键作用，预期在2023年实现技术和产品在全省的宣传和拓展应用。
家禽净化产品目前在江苏、浙江、广东、广西的多家单位开始推广应用，预计在2023年实现全国的大规模推广应用。
2. 预计在2023年完成产品报批准备工作
结合目前的产品验证情况、使用情况，相关推荐单位对产品的应用价值十分认可，必要专利在2022年底可获得授权，同时考虑到疫情影响，预计在2023年能够完成产品的报批工作。

成果成熟度：可以量产
成熟度说明：目前本成果团队已具备量产的能力。知识产权情况： ZL201811422515.5, 国家发明专利，整合四拷贝F18菌毛操纵子基因和双拷贝F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法； ZL201811422062.6, 国家发明专利，整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法； ZL201811421935.1, 国家发明专利，整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用； ZL201910424381.9, 国家发明专利，一种惰性载体大肠杆菌及其潜在应用； ZL201910424369.8, 国家发明专利，一种惰性载体沙门氏菌及其潜在应用； ZL202010400163.4, 国家发明专利，惰性载体间接凝集试验检测系统及其应用； ZL202010428277.X, 国家发明专利，一种泛性型惰性载体大肠杆菌及其潜在应用； ZL202010427735.8, 国家发明专利，一种泛性型惰性载体沙门氏菌及其潜在应用； ZL202011289887.2，国家发明专利，一种表达SEF14功能性菌毛的重组菌及其应用。获奖情况： 2021年度全国颠覆性技术创新大赛优秀项目
转化条件及成果应用事项：前期已做了很好的积累，我们具备商品化研发实力，期待很快商品化和行业应用。
预期交易方式：许可转让

金额：	元
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